過氧化氫響應性白蛋白納米粒的微射流高壓均質制備工藝流程

心臟死亡器官捐獻手術中的熱缺血過程嚴重影響了供體器官的質量，腎臟受到缺血損傷會導致移植后生存率的下降及術后并發癥的出現。為了解決這一臨床問題，研究人員設計構建了一種基于全氟化碳的過氧化氫響應性白蛋白納米粒復合體，結合了二氧化錳的過氧化氫反應產氧能力和全氟化碳優越的溶氧釋氧性質，達到了“產氧-儲氧-釋氧”為一體的氧自供效果。

人血清白蛋白由肝細胞生產，是人體血漿中含量豐富的蛋白質，對于維持機體滲透壓、結合及運輸一些內源性物質（膽紅素、脂肪酸等）及外源性物質（大多數藥物、金屬離子等）具有極其重要的意義。近年來，由于其良好的生物相容性、特別的空間結構及相對簡單又豐富的制備方法，許多研究都將白蛋白作為一種理想的納米藥物載體。

本研究利用高錳酸鉀的強氧化性，以具有還原性的人血清白蛋白為模板進行原位生物礦化得到二氧化錳白蛋白納米粒，利用白蛋白展開與再折疊的自組裝方式形成的納米乳劑將極度疏水的氟碳化合物包載在白蛋白疏水空腔內得到最終具有供氧功能的過氧化氫響應性白蛋白納米粒復合體。本文主要就過氧化氫響應性白蛋白納米粒的微射流高壓均質制備工藝流程及其基本理化性質（包括粒徑大小、化學組成）進行闡述及表征

實驗設備：

粒度分析及電位儀美國Brookhaven

紫外分光光度計日本島津UV-2450

透射電子顯微鏡日本電子株式會社（JEOL）

超聲細胞破碎儀南京先歐有限公司

微射流高壓均質機WST-NANO

恒溫水浴攪拌器IKA

分析天平日本島津制作所

超濾杯德國Millipore8400

離心機德國Eppendorf

氣相色譜儀日本島津GC-2014C

實驗方法：

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的制備工藝：

稱取126.4mgKMnO4粉末溶解于12mL去離子水中，超聲充分溶解。取5mL200mg/mL人血清白蛋白，加入去離子水稀釋到28mL（使終濃度35.7mg/mL），放入37℃恒溫水浴并攪拌情況下，將KMnO4溶液在5分鐘之內逐滴加入到白蛋白溶液中，溶液顏色逐漸變為棕黑色，繼續水浴磁力攪拌反應兩小時。加入去離子水稀釋制備的二氧化錳白蛋白納米粒至100mL，超濾除去游離的KMnO4，反復超濾兩次，直至流出液為無色透明，最終得到40mL二氧化錳白蛋白納米粒體系。取7.22mLFDC與3.14mLFMCP，混勻后加入到稀釋好的二氧化錳白蛋白溶液中，使用移液槍反復吹打多次使全氟化合物在體系中分散均勻，方便超聲乳化。

將上述混合溶液置于冰浴，用超聲細胞破碎儀以35%的功率超聲4個循環（每個循環超聲2分鐘）共8分鐘，得到過氧化氫響應性白蛋白納米粒初乳。將初乳使用微射流高壓均質機均質（以下百分數均為均質機總功率百分數），10%，1min；30%，1min；50%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，放出；20ml體系，均質一個循環用時20s左右，65%壓力下共微射流均質4min，即12個循環。

設置不含二氧化錳的對照組納米粒PHNs，制備流程如下：取5mL200mg/mL人血清白蛋白，加入去離子水稀釋到40mL（使白蛋白終濃度為25mg/mL）。加入7.22mLFDC和3.14mLFMCP，反復吹打混勻后使用超聲細胞破碎儀超聲乳化，進而使用微射流均質機均質得到最終制劑PHNs。超聲方法及微射流均質方法同上述制備過程。

結果

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的制備工藝

在這里，我們使用了一種簡單的一步原位生物礦化方法制備得到了二氧化錳白蛋白納米粒，同時使用超聲乳化方法將全氟化碳FDC和FMCP包裹在白蛋白疏水核心，得到具有供氧能力的過氧化氫響應性白蛋白納米粒。如圖1所示，過氧化氫響應性白蛋白納米粒溶液在自然光線下看呈透亮的棕黑色，溶液體系澄清透亮，迎著光線看可見微微乳光。

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的照片

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的粒徑分布及電位

經Brookhaven電位與粒度儀測定，PHNs與M-PHNs的粒徑大小和分布情況如圖2所示，電位大小如圖3所示?？梢钥闯?，PHNs的平均水合粒徑為148nm，表面電位為-24.7mV，相比較之下，修飾了二氧化錳的M-PHNs其粒徑略微增大至157nm，表面電位下降至-30.7mV。同時，兩種納米粒的粒徑多分散系數（PDI）均小于0.15，證明本研究中所用的納米藥物粒徑分布較為均勻。實驗結果表明我們所制備的M-PHNs納米氧氣發生器具有合適的粒徑大小，適用于后續體內外實驗。表面電位的負電性增大也能夠證明二氧化錳的成功修飾，并且電位偏負電性的納米粒由于在生物體中對細胞的非特異性吸附小使得這類納米粒子具有優異的血液相容性，這些特殊的理化性質為接下來細胞及動物模型中的探索奠定了基礎。

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的粒徑分布情況

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的電位大小

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的紫外吸收光譜

為了進一步驗證M-PHNs中二氧化錳的存在，對M-PHNs及PHNs納米粒進行200-900nm的全波長紫外-可見光掃描（圖4），從圖中可以看出，相比于沒有二氧化錳的PHNs納米粒而言，過氧化氫響應性白蛋白納米粒在380nm左右有一個明顯的吸收峰，與文獻調研的二氧化錳的376nm的特征紫外吸收峰重合，而PHNs納米粒在此位置并無明顯吸收峰，從而驗證了過氧化氫響應性白蛋白納米粒中二氧化錳的存在。而200-300nm的高紫外吸收是由于納米粒中的白蛋白引起的，這一位置的吸收曲線在M-PHNs以及PHNs的吸收圖譜中高度重合。

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的特征紫外吸收光譜

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的氣相色譜圖

過氧化氫響應性白蛋白納米粒中具有攜氧釋氧功能的核心是FDC和FMCP兩種全氟化合物。由于全氟化合物是一種化學惰性物質，其疏水疏油的性質給全氟化合物的檢測帶來了巨大的困難。因此在本研究中，我們利用兩種全氟化合物之間沸點的差異使用氣相色譜檢測的方法驗證M-PHNs中FDC和FMCP的存在。其中，商品化的FDC是由順式和反式兩種同分異構體組成的混合物，因此，在氣相色譜圖中，FDC在保留時間7.5分鐘左右有兩個峰形相似的特征峰，代表FDC的兩種同分異構體（圖5b）。同樣地，商品化的FMCP由于純度為96%，因此在氣相色譜圖中有四個特征峰，保留時間分別為10.31分鐘、10.44分鐘、11.23分鐘和11.39分鐘（圖5c）。對于待測樣品過氧化氫響應性白蛋白納米粒，從結果上可以看到樣品的氣相色譜圖中同時具備FDC以及FMCP的特征峰，分別在保留時間7.29分鐘、7.66分鐘（FDC）以及10.28分鐘、10.45分鐘、11.11分鐘、11.27分鐘（FMCP），充分說明過氧化氫響應性白蛋白納米粒樣品中含有FDC以及FMCP 圖5 

過氧化氫響應性白蛋白納米粒的氣相色譜圖